Krahulec Stefan
Dipl.-Ing. Dr.techn.
Forum Technik und Gesellschaft Förderpreisträger 2010
Kategorie Dissertationen
1. Preis
Titel
Enzymologie und Metabolic Engineering des Zucker/Polyolmetabolismus in Hefe und Pilzen. Charakterisierung des Mannitoldehydrogenasesystems in Aspergillus fumigatus und Metabolic Pathway Engineering für die Xylosefermentation mit Saccharomyces cerevisiae
Kurzfassung
Die Xylosefermentation zur Ethanolproduktion mittels Beckerhefe erfordert die Integration eines zweistufigen oxidoreduktiven Stoffwechselweges. Niedrige Ethanol- und hohe Nebenprodukterträge (v.a. Xylitol) wurden den unterschiedlichen Cofaktorspezifitäten der rekombinanten Enzyme zugeschrieben. Xylosereduktasen (XR) bevorzugen NADPH, während Xylitoldehydrogenasen (XDH) NAD+ abhängig sind. Die Cofaktorspezifität der XDH von G. mastotermitis wurde durch Proteinengineering verändert. Die Kombination einer XDH Mutante mit Mutanten der C. tenuis XR ergab Stämme mit einer ausbalancierten Coenzymverwendung von XR und XDH. Die Charakterisierung der Stämme wurde durch anaerobe Bioreaktorfermentationen im Batch- und Fed-Batch-Betrieb durchgeführt. Die Verteilung der Produkte zeigt, dass die Coenzymregenerierung zwischen XR und XDH eine Voraussetzung für die effiziente Xylosefermentation darstellt, aber nicht ausreichend ist, um eine Xylitolproduktion gänzlich zu unterdrücken. Mannitolmetabolismus in Pilzen erfolgt durch Reduktion von Fruktose-6-Phosphat (Fru6P) zu Mannitol-1-Phosphat durch eine Mannitol-1-Phosphat 5-Dehydrogenase (M1PDH) und anschließender Dephosphorylierung zu Mannitol. Der Katabolismus kann durch die Umkehr dieses Weges erfolgen oder durch die Oxidation von Mannitol zu Fruktose mittels einer Mannitol 2-Dehydrogenase (M2DH). Die biochemische Charakterisierung der M2DH und M1PDH aus A. fumigatus wurde mit Fokus auf Substratspezifität und den kinetischen Mechanismus durchgeführt. Die kinetischen Eigenschaften implizieren einen Anabolismus von Mannitol primär über die Reduktion von Fru6P mittels M1PDH. Die M2DH arbeitet im Organismus hingegen in Oxidationsrichtung.
persönliche Begründung der gesellschaftlichen Relevanz
Hohe ölpreise, Versorgungsunsicherheit und Treibhausgasemissionen haben in den letzten Jahren zu einer steigenden Bedeutung von erneuerbaren Energieträgern geführt. Die Herstellung von Bioethanol aus Agrarprodukten mit hohem Stärke- oder Saccharoseanteil hat dabei zu einem Spannungsfeld zwischen Nahrungsmittel- und Treibstoffproduktion geführt. Im Gegensatz zur Verarbeitung von potentiellen Nahrungsmitteln (Bioethanol der 1. Generation) können Agrarabfälle als kosteneffiziente alternative Rohstoffquellen angesehen werden, die nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittelproduktion stehen (Bioethanol aus Lignocellulose – 2. Generation). Die Kohlenhydratfraktion von Lignocellulosen enthält neben Hexosen (vor allem Glukose) auch große Anteile an Pentosen (vor allem Xylose). Für eine kosteneffiziente Herstellung von Bioethanol aus Agrarabfall ist eine gemeinsame Verwertung von Hexosen und Pentosen notwendig. Während Glukose von der Bäckerhefe effizient zu Ethanol umgesetzt werden kann, ist Xylose kein verwertbares Substrat. Integration eines zweistufigen oxidoreduktiven Stoffwechselweges ermöglicht die Verwertung von Xylose. Hohe Nebenproduktbildungen (vor allem der Zuckeralkohol Xylitol) und geringe Umsetzungsraten stehen dabei einer effizienten Fermentation von Xylose entgegen. Proteinengineering und Design von Prozessparametern wurden in dieser Arbeit erfolgreich genutzt, um sowohl die Nebenproduktbildung zu verringern als auch die Geschwindigkeit der Xyloseverwertung zu erhöhen. Die so gewonnen Erkenntnisse leisten somit einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung einer wettbewerbsfähigen Produktion von Bioethanol der 2. Generation. Während Zuckeralkohole oft unerwünschte Nebenprodukte in biotechnologischen Prozessen (wie der Bioethanolproduktion) darstellen, hat ihr Metabolismus bei Hefen und Pilzen viele physiologische Funktionen wie Kohlenhydratspeicherung und Schutz vor Stressfaktoren. Das Polyol Mannitol kann reaktive Sauerstoffspezien abfangen und so pathogene Pilze vor der Immunantwort ihrer Wirte schützen. Der human pathogene Pilz Aspergillus fumigatus gilt als der verbreiteteste Krankheitserreger von Aspergillose und stellt vor allem für immunsupremierte Menschen eine tödliche Bedrohung dar. Mannitol wird von A. fumigatus in großen Mengen produziert und kann daher als ein potentieller Virulenzfaktor angesehen werden. Diese Dissertation beinhaltet eine detaillierte biochemische Charakterisierung der zentralen Enzyme des Mannitolstoffwechsels dieses Pilzes und leitet daraus physiologische Implikationen ab. Die gewonnen Erkenntnisse könnten eine Basis für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden von Pilzerkrankungen durch A. fumigatus darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu einer ansehnlichen Anzahl von Veröffentlichungen in peer reviewed journals: 4 bereits erschienen (als Erstautor), 1 eingereichte Arbeit, 1 in Vorbereitung und 3 weitere in Planung. Zusätzlich wurden die Resultate im Rahmen mehrerer Vorträge auf internationalen Konferenzen vorgestellt. Die Arbeit ist nicht nur von grundlegendem biochemischem Interesse sondern auch von Bedeutung für die Optimierung der Bioethanol Produktion mittels Bäckerhefe sowie der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden gegen Aspergillose.
Kategorie Dissertationen
1. Preis
Titel
Enzymologie und Metabolic Engineering des Zucker/Polyolmetabolismus in Hefe und Pilzen. Charakterisierung des Mannitoldehydrogenasesystems in Aspergillus fumigatus und Metabolic Pathway Engineering für die Xylosefermentation mit Saccharomyces cerevisiae
Kurzfassung
Die Xylosefermentation zur Ethanolproduktion mittels Beckerhefe erfordert die Integration eines zweistufigen oxidoreduktiven Stoffwechselweges. Niedrige Ethanol- und hohe Nebenprodukterträge (v.a. Xylitol) wurden den unterschiedlichen Cofaktorspezifitäten der rekombinanten Enzyme zugeschrieben. Xylosereduktasen (XR) bevorzugen NADPH, während Xylitoldehydrogenasen (XDH) NAD+ abhängig sind. Die Cofaktorspezifität der XDH von G. mastotermitis wurde durch Proteinengineering verändert. Die Kombination einer XDH Mutante mit Mutanten der C. tenuis XR ergab Stämme mit einer ausbalancierten Coenzymverwendung von XR und XDH. Die Charakterisierung der Stämme wurde durch anaerobe Bioreaktorfermentationen im Batch- und Fed-Batch-Betrieb durchgeführt. Die Verteilung der Produkte zeigt, dass die Coenzymregenerierung zwischen XR und XDH eine Voraussetzung für die effiziente Xylosefermentation darstellt, aber nicht ausreichend ist, um eine Xylitolproduktion gänzlich zu unterdrücken. Mannitolmetabolismus in Pilzen erfolgt durch Reduktion von Fruktose-6-Phosphat (Fru6P) zu Mannitol-1-Phosphat durch eine Mannitol-1-Phosphat 5-Dehydrogenase (M1PDH) und anschließender Dephosphorylierung zu Mannitol. Der Katabolismus kann durch die Umkehr dieses Weges erfolgen oder durch die Oxidation von Mannitol zu Fruktose mittels einer Mannitol 2-Dehydrogenase (M2DH). Die biochemische Charakterisierung der M2DH und M1PDH aus A. fumigatus wurde mit Fokus auf Substratspezifität und den kinetischen Mechanismus durchgeführt. Die kinetischen Eigenschaften implizieren einen Anabolismus von Mannitol primär über die Reduktion von Fru6P mittels M1PDH. Die M2DH arbeitet im Organismus hingegen in Oxidationsrichtung.
persönliche Begründung der gesellschaftlichen Relevanz
Hohe ölpreise, Versorgungsunsicherheit und Treibhausgasemissionen haben in den letzten Jahren zu einer steigenden Bedeutung von erneuerbaren Energieträgern geführt. Die Herstellung von Bioethanol aus Agrarprodukten mit hohem Stärke- oder Saccharoseanteil hat dabei zu einem Spannungsfeld zwischen Nahrungsmittel- und Treibstoffproduktion geführt. Im Gegensatz zur Verarbeitung von potentiellen Nahrungsmitteln (Bioethanol der 1. Generation) können Agrarabfälle als kosteneffiziente alternative Rohstoffquellen angesehen werden, die nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittelproduktion stehen (Bioethanol aus Lignocellulose – 2. Generation). Die Kohlenhydratfraktion von Lignocellulosen enthält neben Hexosen (vor allem Glukose) auch große Anteile an Pentosen (vor allem Xylose). Für eine kosteneffiziente Herstellung von Bioethanol aus Agrarabfall ist eine gemeinsame Verwertung von Hexosen und Pentosen notwendig. Während Glukose von der Bäckerhefe effizient zu Ethanol umgesetzt werden kann, ist Xylose kein verwertbares Substrat. Integration eines zweistufigen oxidoreduktiven Stoffwechselweges ermöglicht die Verwertung von Xylose. Hohe Nebenproduktbildungen (vor allem der Zuckeralkohol Xylitol) und geringe Umsetzungsraten stehen dabei einer effizienten Fermentation von Xylose entgegen. Proteinengineering und Design von Prozessparametern wurden in dieser Arbeit erfolgreich genutzt, um sowohl die Nebenproduktbildung zu verringern als auch die Geschwindigkeit der Xyloseverwertung zu erhöhen. Die so gewonnen Erkenntnisse leisten somit einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung einer wettbewerbsfähigen Produktion von Bioethanol der 2. Generation. Während Zuckeralkohole oft unerwünschte Nebenprodukte in biotechnologischen Prozessen (wie der Bioethanolproduktion) darstellen, hat ihr Metabolismus bei Hefen und Pilzen viele physiologische Funktionen wie Kohlenhydratspeicherung und Schutz vor Stressfaktoren. Das Polyol Mannitol kann reaktive Sauerstoffspezien abfangen und so pathogene Pilze vor der Immunantwort ihrer Wirte schützen. Der human pathogene Pilz Aspergillus fumigatus gilt als der verbreiteteste Krankheitserreger von Aspergillose und stellt vor allem für immunsupremierte Menschen eine tödliche Bedrohung dar. Mannitol wird von A. fumigatus in großen Mengen produziert und kann daher als ein potentieller Virulenzfaktor angesehen werden. Diese Dissertation beinhaltet eine detaillierte biochemische Charakterisierung der zentralen Enzyme des Mannitolstoffwechsels dieses Pilzes und leitet daraus physiologische Implikationen ab. Die gewonnen Erkenntnisse könnten eine Basis für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden von Pilzerkrankungen durch A. fumigatus darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu einer ansehnlichen Anzahl von Veröffentlichungen in peer reviewed journals: 4 bereits erschienen (als Erstautor), 1 eingereichte Arbeit, 1 in Vorbereitung und 3 weitere in Planung. Zusätzlich wurden die Resultate im Rahmen mehrerer Vorträge auf internationalen Konferenzen vorgestellt. Die Arbeit ist nicht nur von grundlegendem biochemischem Interesse sondern auch von Bedeutung für die Optimierung der Bioethanol Produktion mittels Bäckerhefe sowie der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden gegen Aspergillose.